杜鹃：今天是反义RNA病毒最后一站——仙台病毒(Sendai Virus)。

简介

        鼠呼吸道病毒(Murine Respirovirus)，以前称为仙台病毒(SeV)、鼠副流感病毒1型或日本血凝病毒 (HVJ)，是一种有包膜、直径为150-200nm、反义的单链RNA病毒。它通常感染啮齿动物，对人类或家畜没有致病性。仙台病毒 (SeV) 是呼吸道病毒家族(Respirovirus)的成员。该病毒于1950年代初在日本仙台市被分离出来。 从那时起，它作为模型病原体被积极用于研究。 该病毒对许多癌细胞系具有传染性，在动物模型和动物自然发生的癌症中具有溶瘤特性。SeV融合真核细胞和形成合胞体的能力被用来生产能够大量制造单克隆抗体的杂交瘤细胞。 基于SeV的载体的最新应用包括将体细胞重编程为诱导多能干细胞和疫苗生产。 出于疫苗接种目的，基于仙台病毒的构建体可以以滴鼻剂的形式递送，这可能有益于诱导粘膜免疫反应。SeV有几个特征对于成功疫苗的载体很重要：病毒不会整合到宿主基因组中，不会进行基因重组，它只在细胞质中复制，没有DNA中间体，并且不会引起人类或家畜的任何疾病。 仙台病毒被用作开发针对引起结核病的结核分枝杆菌、针对导致AIDS的HIV-1和针对导致儿童呼吸道感染的呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的支柱。 针对结核分枝杆菌的疫苗开发处于临床前阶段，针对HIV-1的疫苗已进入II期临床试验，针对RSV的疫苗处于I期。复旦大学与ID Pharma Co.Ltd.合作开发预防COVID-19的疫苗。在该项目中，SeV充当疫苗骨架载体。

病毒结构

        仙台病毒是一种有包膜的病毒：它的外层是一个脂质包膜，里面含有糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(HN)，具有两种酶活性(血凝素和神经氨酸酶)。血凝素(H)用作细胞附着因子和膜融合蛋白。神经氨酸酶(NA)是一种唾液酸酶，可从宿主细胞表面切割并去除唾液酸。 这种切割促进了病毒脂质包膜与细胞外膜的融合。

       在病毒的脂质包膜中还存在融合蛋白(F)，也是一种糖蛋白，可确保病毒在病毒吸附后进入宿主细胞。 脂质膜下方是基质蛋白(M)；它形成病毒包膜的内层并稳定其结构。SeV病毒粒子含有核衣壳核，核衣壳核由基因组RNA、核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)组成。磷蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)的病毒的一个基本亚基，而大蛋白(L)是该聚合酶的一个催化亚基。C蛋白由P基因编码mRNA的另一个阅读框翻译而来，它也与病毒衣壳相关。它在SeV病毒粒子中存在的水平相对较低(40个分子/基因组)。

病毒基因组

        非分段反义RNA病毒的基因组同源重组率低，进化相对缓慢。造成这种基因组稳定性的原因可能有多种：(1)这些病毒的基因组是非分段的，因此不能进行基因重排。(2)每种蛋白质和每种氨基酸都具有重要的功能。 因此，任何新的基因插入、替换或缺失都会导致功能降低或完全丧失，进而导致新病毒变体的生存能力降低。(3)仙台病毒属于受“六碱基法则”支配的病毒。SeV基因组作为其他副粘病毒的基因组主要包括六个基因，编码六个主要蛋白质。副粘病毒中同源 RNA 重组率低可能是由于这种对多六聚体长度(6n)不寻常的基因组要求造成的。SeV的天然高基因组稳定性是其潜在用作疫苗载体或溶瘤剂的积极特征。对于任何临床或工业应用，重要的是SeV基因组和插入的外源转基因将以稳定的方式表达。遗传稳定性能够在细胞培养物或鸡胚中进行多次连续传代，而不会发生病毒基因组变化。

细胞蛋白酶的蛋白水解切割

       SeV F蛋白是一种I型膜蛋白，由无活性前体(F0)合成，必须通过残基精氨酸116处的蛋白水解裂解激活。裂解F0前体后产生两个二硫键连接的亚基F1和F2。副粘病毒使用不同的宿主细胞蛋白酶来激活它们的F蛋白。 仙台病毒使用活化蛋白酶，即以类胰蛋白酶β2-(TPSB2)为代表的丝氨酸内肽酶，如类胰蛋白酶II、类胰蛋白酶Clara、团状细胞类胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶) 胰蛋白酶1 (PRSS1)、 微型纤溶酶 (PLG)和跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)。最有可能的是，凝血因子X (F10) 能够切割和激活SeV F0。其他尚未鉴定的细胞蛋白酶也可能处理SeV的F0蛋白。

SeV细胞进入受体

       包膜中含有HN的呼吸道病毒、禽腮腺炎病毒和大多数腮腺炎病毒株使用唾液酸作为它们的细胞进入受体。SeV作为呼吸道病毒的代表，使用含有唾液酸残基的分子，如糖蛋白和鞘糖脂(神经节苷脂)。SeV也可以使用凝集素进入细胞，三种SeV受体由分化簇的分子代表。一些SeV受体在癌细胞中过度表达，因此，SeV可以在癌细胞内繁殖。

生命周期

       由于 SeV 是一种反义RNA病毒，病毒的整个生命周期都是在细胞质中使用其自身的RNA聚合酶完成的。

吸附与融合

        仙台病毒通过识别特定受体分子介导的宿主细胞吸附来启动感染过程。血凝素神经氨酸酶(HN)作为一种病毒细胞附着蛋白，与特定的细胞进入受体相互作用。HN具有唾液酸酶活性，能够从细胞受体上切割唾液酸残基。 这种切割触发了病毒包膜和细胞膜的融合过程，通过HN与病毒融合蛋白(F)的合作促进了这一过程。为了执行融合功能，F蛋白必须从其前体无活性形式F0中被蛋白水解激活，这种激活需要在病毒吸附之前由宿主蛋白酶进行F0切割。

脱壳

       在宿主膜和病毒包膜合并后，根据一种模型，SeV被“脱壳”，病毒包膜蛋白扩散到宿主质膜中。根据另一种模型，病毒不会将其包膜蛋白释放到宿主膜中。 病毒膜和宿主膜融合在一起，形成连接结构。 这种连接结构充当病毒核糖核蛋白(RNP)的运输“高速公路”。因此，RNP 穿过连接结构到达细胞内部，允许SeV遗传物质进入宿主细胞的细胞质。

细胞质转录和复制

         一旦进入细胞质，SeV基因组RNA就会作为模板参与由依赖于RNA的RNA聚合酶(由L和P蛋白组成)执行的两种不同的RNA合成过程：转录以生成mRNA和RNA依赖RNA聚合酶促进mRNA甲基化帽结构的产生。 

        NP蛋白被认为具有结构和功能作用这种蛋白质浓度被认为调节从RNA转录到RNA复制的转换。基因组RNA作为病毒RNA转录的模板，直到NP蛋白浓度增加。随着NP蛋白的积累，发生从转录到复制的转变。NP蛋白包裹基因组RNA，形成螺旋核衣壳，它是病毒 RNA 聚合酶合成RNA的模板。该蛋白质是以下复合物NP-P、NP-NP、NP-L和RNA-NP的重要成分。所有这些复合物都是病毒RNA复制所必需的。 

翻译

         从病毒mRNA翻译出两组不同的蛋白质。 第一组由六种结构蛋白代表，包括核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、神经氨酸酶(NA)和大蛋白(L)。所有这些蛋白质都具有不同的功能并被整合到病毒核衣壳中。 第二组由七个非结构或辅助蛋白质代表。这些蛋白质是从P基因的多顺反子mRNA翻译而来的。该mRNA编码八种翻译产物，P蛋白只是其中之一。翻译的替代变体由V、W、C、C'、Y、Y'和X蛋白表示。蛋白质C'、C、Y1、Y2是mRNA替代阅读框的产物，它们统称为C-蛋白质或C-嵌套蛋白质，它们共享共同的C-末端。X蛋白也共享相同的C末端，其翻译也由核糖体独立启动。蛋白质V和W是共转录mRNA编辑的产物。 所有这些非结构蛋白都具有多种功能，包括组织病毒RNA合成和通过逃避宿主先天免疫帮助病毒感染宿主细胞

病毒蛋白向细胞膜的运输

        翻译后，为出芽过程做准备，三种病毒亲脂蛋白HN、F和M迁移到宿主细胞膜并与之结合。 

 合胞体形成和直接细胞间感染传播

        两种SeV蛋白：HN和F，在它们直接与细胞膜结合后，会促进胞间融合，从而形成大的多核细胞(合胞体)。 这种形成涉及受感染细胞与相邻靶细胞的融合，并且仍然是病毒成分在细胞间直接传播的重要机制。 因此，在部分组装的病毒粒子中以遗传物质形式存在的SeV感染可以在不暴露于宿主中和抗体的情况下传播。

出芽

        仙台病毒与所有其他包膜病毒一样，使用宿主细胞膜脂双层来形成病毒衣壳膜。 病毒蛋白(M、HN和F)与宿主细胞膜的结合促进了它们与 RNP 复合物的相互作用，该复合物由与SeV 蛋白(NP、P 和 L)结合的病毒基因组RNA组成。因此，所有病毒结构成分，包括病毒糖蛋白和基因组RNP复合物，都组装在一起。 在这种组装之后，感染性病毒颗粒从单独或集体感染的细胞(合胞体)中出芽释放。C蛋白通过与AIP1/Alix相互作用促进出芽，AIP1/Alix是一种参与细胞凋亡和内体膜运输的宿主蛋白。传染性病毒颗粒通常在感染后24小时(hpi)释放，峰值滴度出现在48至72hpi之间

持续感染

         仙台病毒可以在其宿主细胞中建立持续感染，多轮病毒传代培养产生具有高建立持续感染能力的新病毒变体。这些SeV变体会产生某些基因型变化。持续感染也可以在干扰素调节因子3(IRF-3)敲低细胞中立即建立。IRF-3是一种关键的促凋亡蛋白，在被 SeV 激活后会触发细胞凋亡。IRF-3敲除细胞表达病毒蛋白并产生低水平的感染性病毒粒子。IRF-3通过触发细胞凋亡和阻止持久性建立来控制SeV感染细胞的命运； 因此，它的敲除允许持久性发生。据报道，在SeV感染复制期间，缺陷病毒基因组(DVG)正在形成并选择性地保护宿主细胞亚群免于死亡，从而促进持续感染的建立。在自然界中，地方性动物疾病模式表明该病毒可以潜伏并在一年内被清除。

诱导细胞融合

        仙台病毒与其所在的呼吸道病毒成员共有的一个公认特征是在真核细胞培养物中诱导体内和体外合胞体形成的能力。合胞体的形成有助于病毒在感染传播过程中避免中和宿主生物的抗体。这一过程的机制已被很好地理解，并且与病毒粒子为促进细胞进入而采用的融合过程非常相似。 受体结合血凝素-神经氨酸酶蛋白的活性仅负责诱导病毒包膜和细胞膜之间的密切相互作用。

        当被局部脱水和结合的HN蛋白的构象变化时，F蛋白主动插入细胞膜，导致病毒包膜和细胞膜融合，随后不久病毒粒子进入。当HN和F 蛋白由细胞制造并在表面表达时，相邻细胞之间可能会发生相同的过程，导致广泛的膜融合并导致合胞体的形成。 

        科勒和米尔斯坦利用了SeV的这种行为，他们在 1975 年发表了一篇文章，概述了制造单克隆抗体的革命性方法。需要一种可靠的方法来生产大量的特异性抗体，两者合并了一个暴露于选定抗原的单克隆B细胞和一个骨髓瘤肿瘤细胞，以产生杂交瘤，能够无限生长并产生大量的特异性靶向所选抗原的抗体。 虽然后来发现了更有效的方法来创造这种混合体，但科勒和米尔斯坦首先使用仙台病毒来创造他们的革命性细胞。

基因工程

        自1950年代后期以来，研究界对SeV的了解越来越多，并且它已被广泛用于创建基因工程构建体的多种变体，包括用于转基因递送的载体。与其他病毒相比，SeV基因构建体的创建更容易，许多SeV基因具有转录起始和终止信号。 因此，构建重组病毒很简单； 可以通过替换或添加病毒蛋白表达基因将外源基因引入病毒基因组。SeV可以包含一个外源基因甚至多个大基因。已经证明可以在SeV中插入和表达超过3kb的基因。由于完全是细胞质复制，该病毒不会携带遗传整合到宿主基因组中的风险，这对于许多其他病毒载体来说是一个问题。SeV的基因组与其他非分段反义RNA病毒的基因组一样，同源重组率低，进化相对缓慢。 存在这种基因组稳定性的多种原因：(1)基因组是非分段的，因此不能进行遗传重配，(2)每种蛋白质和每种氨基酸都具有重要的功能。 因此，任何新的基因插入、替换或缺失都会导致功能降低或完全丧失，进而导致新病毒变体的生存能力降低。(3)仙台病毒属于受“六碱基法则”支配的一类病毒。SeV基因组作为其他副粘病毒的基因组，主要包括6个基因，编码6个主要蛋白质。 副粘病毒中同源RNA重组率低可能是由于这种对多六聚体长度(6n)不寻常的基因组要求造成的。SeV 的天然高基因组稳定性是其潜在用作疫苗载体或溶瘤剂的积极特征。对于任何临床或工业应用，重要的是SeV基因组和插入的外源基因将以稳定的方式表达。由于SeV遗传稳定性，病毒构建体在细胞培养物或鸡胚中的多次连续传代是可能的，而不会发生剧烈的基因组变化。

附带一提

        在发现仙台病毒之前，呼吸道病毒、水生动物副黏病毒、费尔拉病毒与亨尼帕病毒还是属于麻疹病毒家族。但是随着仙台病毒的发现，它们最终分道扬镳，于是麻疹病毒家族就剩麻疹病毒这一个独苗。

总结

        在此对反义RNA病毒做一个总结。反义RNA病毒在RNA复制时，不会形成双链RNA，因此反义RNA基因重组率低。但是，正黏病毒与布尼亚病毒基因重组率很高。

       大多数感染人类的正义RNA病毒与反义RNA病毒很多都是著名的病原体。例如正义RNA病毒中的黄热病病毒、西尼罗病毒、奇昆古尼亚病毒、委内瑞拉马脑炎病毒。例如反义RNA病毒中的狂犬病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒。

       大多数感染人类的RNA病毒都是在细胞质内完成复制，只有少数病毒，例如博尔纳病毒、流感病毒、索戈托病毒、夸兰扎病毒在细胞核内复制。

       少数反义RNA病毒，例如博尔纳病毒具有类似逆转录病毒编辑正义RNA的能力以及整合入宿主DNA的能力。一些体外实验证明，部分反义RNA病毒基因组可以整合入宿主DNA的能力，证明逆转录病毒是由反义RNA病毒进化而来。

        下期介绍的病毒，是逆转录病毒。

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