细胞基础实验（细胞复苏，细胞传代，细胞铺板及细胞冻存）技术分享

      大家好啊，我是冠男。今天要给大家分享的是分子生物学实验中常用的一项技术：细胞基础实验（包括细胞复苏，细胞传代，细胞铺板及细胞冻存）。细胞实验可以说是做生物学实验的人几乎都会遇见的一项技术。

    体外培养（in vitro culture）就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法，主要包括细胞培养、组织培养及器官体外培养，下面主要介绍的是细胞体外培养。细胞培养更具有特殊的作用和价值，比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的：基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体，杂交瘤单克隆抗体，基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。笔者总结了一些细胞相关的基础实验（包括细胞复苏，细胞传代，细胞铺板及细胞冻存）。下面我将会从实验准备、实验步骤、实验解析三个方面来进行介绍。

细胞复苏

实验准备：

细胞培养皿/瓶，离心管，垃圾桶，枪头，紫外灭菌，提前准备37℃温水。

实验步骤：

1取10/15ml离心管于试管架，加入2-9ml培养基。

2解冻细胞（37-40°化冻时间<1min）

3转移细胞

4离心1000rpm，5min，Room temperature

5弃去上清培养基，加入1ml培养基重悬，转移至准备好的细胞培养皿中（标记细胞名称，复苏时间，细胞代数等）

6十字交叉法混匀，镜下观察，转移至恒温恒湿（37℃，5% CO2）细胞培养箱中。

实验解析：

细胞复苏主要包括细胞解冻——离心去除DMSO——细胞转移培养三个步骤。

在这其中，细胞解冻尤为关键，解冻时越快越好，放入37℃水浴锅的同时快速晃动，加速解冻时间，一般解冻时间小于1min。解冻时间过长可能会导致细胞内的冰晶碎片损伤细胞。

DMSO极易透过细胞膜，且会抑制细胞增殖。如果细胞对DMSO敏感，可以适度增加离心时间和离心次数。

细胞传代

实验准备：细胞培养皿/瓶，离心管，垃圾桶，10%FBS培养基，PBS，胰酶等

实验步骤：

1.镜下观察细胞密度及形态，待密度达到80-90%时进行传代

2.取出细胞，PBS清洗*2

3.取适量胰酶进行消化，待细胞呈白雾状时终止消化

4. 2倍体积培养基终止消化，吹打细胞，转移至10ml离心管

5.1000g，5min，RT离心

6.弃去上清，培养基重悬细胞，按1：2-1：4转移至新的培养皿

实验解析：

细胞传代主要包括细胞清洗——胰酶消化——细胞离心转移等几个步骤

在这其中，作者认为比较重要的是胰酶消化细胞这一个步骤。在进行消化前，首先需要用枪头洗干净清洗细胞的PBS（PBS残留可能会稀释胰酶，影响消化）。其次，可根据细胞的习性选择胰酶类型（是否添加EDTA，EDTA可以螯合+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+等，降低细胞粘连，从而加速细胞脱落的过程）。最后很多同学在细胞消化时都喜欢计时，但笔者感觉计时其实并不算非常的准确，因为胰酶的活力是和环境的温度有关，在冬天消化和在夏天消化无论如何都会存在一些偏差。笔者常用的方法为不停的来回晃动细胞，观测细胞是否出现白雾，然后可以不定时的适当取一些消化中的胰酶轻轻吹打细胞，观察细胞是否易于脱落，防止细胞消化过度（但是有一些细胞非常的薄，需要仔细观察）。

细胞铺板

实验准备：细胞培养皿/瓶，细胞板、离心管，垃圾桶，培养基，PBS，胰酶等。

实验步骤：

1.镜下观察细胞密度及形态，待密度达到80-90%时传代

2.取出细胞PBS（5ml）洗*2

3.2ml胰酶消化，细胞呈白雾状

4.2倍体积培养基终止消化，吹打细胞，转移至10ml离心管

5.1000g，5min，RT离心（这些步骤同细胞传代）

6.1-3ml重悬，细胞计数板计数

计数四个角，公式C=a/4*104

7.铺板/传代

96孔板6-8*103，12孔板1*105，6孔板2*105，具体参照实验情况

细胞铺板过程中比较关键的是细胞的计数，然后计数后转化为每孔细胞数（每孔具体加多少微/毫升细胞等）。

细胞计数记细胞计数板的四角，遵循计上不计下，计左不计右原则，计数公式为：细胞悬液细胞数/mL = 4个大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数。

举个栗子：假设我现在四个大格子细胞总数是400（1ml稀释），然后我要铺一个6孔板，每个孔铺2*105个细胞。那么依据细胞计数的公式，现在我这1ml细胞稀释液中共有细胞1000 000（1*106）个/ml。那我设我取x ml细胞就是2*105个细胞。这样得到2*105=1*106 × X，得出X=0.2 ml，所以6孔板中每孔加入200μl细胞悬液。

好像讲的有点乱，大家可以多看两遍，参悟一下（手动狗头）。

这里有一些其它朋友计数的经验，也可以参考一下：

https://zhuanlan.zhihu.com/p/386579051

细胞冻存

实验准备：培养皿，冻存管、离心管，垃圾桶（干湿分离），枪头，培养基，PBS，胰酶，血清，DMSO等

实验步骤：

1.镜下观察细胞密度及形态，待密度达到80-90%时传代

2.取出细胞PBS（5ml）洗*2

3.2ml胰酶消化，细胞呈白雾状

4.2倍体积培养基终止消化，吹打细胞，转移至10ml离心管

5.1000g，5min，RT离心（此步骤前同细胞传代）

6.900μl重悬加入100μlDMSO

7.异丙醇冻存盒-80℃过夜冻存，或梯度冻存4℃ 10-30min，-20℃ 30-1h，-80℃过夜，转移至液氮中

实验解析：

细胞冻存主要包括细胞消化及细胞冻存等几个步骤

消化步骤注意事项同前所述。

细胞冻存需要注意的是在第五步离心之后，加入DMSO（DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用）冻存液时，DMSO与细胞培养液融合时会产生大量的热，所以需要快速吹打，减少细胞损伤。然后冻存时如果有冻存盒，细胞可以放入冻存盒（一般含有异丙醇，起到程序性降温的作用）中直接放入-80℃冰箱，没有冻存盒可以使用梯度降温的方法，如前所述。

本文作者：LGN

审核：小猪

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       本文主要分享了一些细胞实验相关的基础的知识。作者能力有限，一些更深层次的内容欢迎大家在讨论区补充，也欢迎有相关研究方向的学者一起讨论交流，谢谢大家！