实验二十四、酵母菌的纯培养

上节课中果酒、果醋的发酵利用的是果皮和空气中的野生酵母菌和醋酸菌。这样的发酵方式效率较低，而且在最开始的时候其他杂菌也在繁殖可能产生一些有害的副产物（如甲醇），影响果酒、果醋的品质。在发酵液中接种相应的微生物是提高发酵效率方法之一。此次的实验我们将借助基本的微生物培养技术分离纯化果酒中的酵母菌，并计算种群密度、保留菌种。

材料用具

土豆、葡萄糖、琼脂、天平、蒸馏水、纱布、1 L烧杯、500 mL锥形瓶、棉塞、电热炉、培养皿、带塞试管、旧报纸、橡皮筋、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、打火机、酒精喷壶或酒精棉、自制发酵酒或甜酒水、接种环、可调移液器、记号笔、恒温培养箱、血细胞计数板（选用）、超净工作台（选用）。

步骤

1.监测自制酒中酵母菌种群密度变化（选做）

用血细胞计数板对发酵液中的酵母菌每天进行种群密度的检测，方法见实验十九“培养液中酵母菌种群数量的变化”。

2.配制培养基

将100g土豆加400 mL水煮沸20分钟，纱布过滤。再加入10 g葡萄糖、10g 琼脂，溶解后加水定容至500 mL，配制成土豆培养基。将培养基的一部分分装到用于保藏菌种的试管中，占试管体积的1/3即可（选做）。其余的倒入锥形瓶中，将试管和锥形瓶塞上塞子。

3.灭菌

将培养基、培养皿、试管用旧报纸包裹起来，移液器吸头装入吸头盒。将这些耗材放入高压蒸汽灭菌锅中，在加压100kPa、121℃的条件下加热15分钟灭菌。灭菌结束后将耗材取出，等待冷却，其中装有培养基的试管应倾斜放置，待冷却后制成斜面保藏培养基（图1）。

4.倒平板

先对双手和桌面喷洒70~75%酒精消毒，待酒精挥发后点燃酒精灯。等培养基冷却到放到手背上感觉不烫的时候，开始倒平板。用左手拿起一套培养皿，中指托住下皿，食指和大拇指扣住上盖。右手拿锥形瓶在酒精灯火焰上掠过后，用左手小拇指拔下棉塞，将瓶口和培养皿口在火焰上掠过，然后用大拇指将培养皿的上盖打开一个小口，将培养基从开口处倒入培养皿（图2）。培养基铺满培养皿底部后，再次灼烧培养皿口和锥形瓶口，合上培养皿，塞上瓶塞，将培养皿放在桌面上，接着开始倒下一个平板，至少倒3个。

5.平板划线法接种

将接种环在酒精灯上灼烧，冷却的过程中摇匀自制酒。用接种环蘸取一环自制酒，另一只手取一个平板，将皿口掠过火焰后，打开培养皿，用蘸有自制酒的接种环在培养基上划出3条平行线（图3），注意不要将培养基划破。再次灼烧接种环，冷却后从第一次划线的末端开始第二次划线，稀释菌液。重复四到五次，注意最后一次的划线不要与第一次相连。接种完成后在培养皿底部做好标记。

6.培养及观察

将培养皿放入28℃的恒温培养箱中倒置培养48 h（图4）。倒置培养是因为如果培养基在下面，水蒸气会凝结在皿盖上，滴下的水会破坏菌落原有的形态，影响实验结果。培养结束后观察菌落形态（图5），记录在实验报告上。

7.保藏菌种（选做）

一只手拿起长有单菌落的平板，再取一支斜面保藏培养基夹在这只手的无名指和小拇指之间，灼烧接种环后，打开培养皿盖，用冷却的接种环挑取一个单菌落。在火焰上掠过培养皿口和试管口后，合上培养皿，用另一只手的小拇指拔下棉塞，将菌种成S形划在斜面培养基上，灼烧管口后塞上棉塞（图6）。在28℃恒温培养箱中培养24 h，长出菌落后（图7）放在冰箱中保存。

讨论

（略）

实验报告

（略）