RNA测序技术简介

RNA测序（RNA-seq）是转录组学研究的重要工具，也是生命科学领域最常用的技术之一。相比于传统通路研究低维度、低通量的局限性，转录组学有以下优势：1）能够动态考察细胞基因组的表达，多维度地反映差异变化；2）可用于研究占RNA绝大部分的非编码RNA，研究其结构以及在细胞生命活动中的重要调控作用；3）与蛋白组学研究相互补充，更全面地呈现细胞水平的变化信息。作为转录组学研究的技术基础，RNA测序技术也在不断地更新迭代。本文将对第一代至第三代测序技术的原理和特点进行简要的介绍。注：除Direct-Seq外的测序技术都涉及到DNA链的合成，当用于RNA测序时，会先通过逆转录PCR（RT-PCR）合成cDNA文库，再进行测序。

第一代测序技术（Sanger Method）

第一代测序技术由Fred Sanger提出，被称为Sanger Method，是分子测序领域“从无到有”的重大突破。此方法基于常规的PCR技术以及特殊的原料ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）。在PCR扩增时，四种ddNTP分别被加入体系中，由于ddNTP缺少3’-OH基团，不具备形成磷酸二酯键的能力，理论上可以终止在模板链上的任意位置。此外,这些ddNTP上连接有放射性同位素标记，通过凝胶电泳分离后可被凝胶成像系统所检测并分析（图1）。基于这一方法也开发出了能够自动化荧光测序的仪器（图2）。由于一代测序技术步骤繁琐耗时，测序通量低，读长短且成本高昂，无法满足目前组学研究的需求。

图1 | Sanger Method的基本原理和流程图

图2 | 基于Sanger Method的自动化荧光测序技术

第二代测序技术（Short Read RNA-seq）

第二代测序技术在测序方法上取得了重大突破，基于“边合成边测序”（sequencing by synthesis）和大规模平行测序技术（massive parallel analysis,MPS），使测序通量和读取速度得到极大提升，其中最具代表性的是Illumina Solexa测序仪。Illumina的测序原理可以简化为四步：样品文库构建、簇生成、测序和数据分析。由于读长限制，样品DNA或由RNA逆转录得到的cDNA需要被打断成300-500bp的片段，并在3'和5'端接上3种序列：1）Index，用于区分样品来源；2）Adapter，用于结合测序通道上的位点；3）Primer binding site，用于结合PCR引物启动扩增反应。基于桥式PCR技术的簇生成可以将模版链迅速扩增成千上万倍，保证过程中足够的测序深度。测序时使用特殊标记的dNTP：1）碱基上通过敏感键修饰上不同的荧光基团，用于区分ATCG；2）3'端使用叠氮基团封闭，保证一次循环只上一个dNTP（图3）。每一轮循环结束时，会通过高速荧光显微镜记录荧光图像，再通入试剂除去荧光基团和叠氮基团，开启下一循环。通过分析读取同一位点的荧光，实时获取模版链的碱基序列。由于过程中使用的化学反应并不可控，随着循环数的增大会出现不同步的情况，因此Illumina的读长只能限制在200bp左右。但由于极高的测序通量和准确率，Illumina仍占有目前最高的市场份额。

图3 | Illumina技术原理示意图

第三代测序技术（Long Read RNA-seq）

由于Illumina测序前需要事先将样本链打碎，测序后通过软件去还原完整的序列，而且单次读长限制在200bp以内，在做全转录组分析时可能会丢失相当一部分信息，而第三代测序技术恰恰弥补了这一短板。第三代技术有两种：1）单分子实时测序技术（SingleMolecular Real-Time Sequencing，SMRT），仍需要RT-PCR构建cDNA文库，代表是Pracific Bioscience测序仪；2）直接测序技术（DirectRNA-seq），代表是OxfordNanopore测序仪。

1. SMRT：PracificBiosciences

SMRT技术无需打碎样品，通过在模板两端接上Adapter构建成环形DNA分子。Pracific Biosciences测序仪的工作池中含有成千上万个微孔，一个微孔只能装载一个DNA-聚合酶复合物（图4）。与二代技术不同，SMRT使用的dNTP的荧光基团修饰在5’的三磷酸上，当磷酸二酯键形成后，荧光基团淬灭离去。将高速荧光显微摄像机和低穿透性的激光相结合，dNTP通过碱基互补配对结合到模板链上的瞬间产生荧光信号被捕获，合成后信号淬灭，保证一次仅读取一个碱基。SMRT容易产生错读，错误率约为12.5%，但所幸误差是随机的，利用此平台的Circular Consensus Sequencing模式对单个分子反复测序，即可得到高保真的序列信息（准确率>99.9%），但此模式会进一步消耗测序通量，使得测序深度过低。SMRT的另一个模式Continuous Long Read则是专门用于超长序列（可至50k bp）的读取。由于无需打碎，SMRT技术简化了样品处理流程，且能够实现超长序列的完整分析，方便用于全转录组学的分析研究。

图4 | Pacific Biosciences测序仪

2. Direct RNA-seq：Oxford Nanopore

由于前几代技术用于RNA测序都要通过RT-PCR构建cDNA文库，使样品准备流程繁琐，且会引入一定的系统误差。此外，前几代技术都无法用于碱基修饰、mRNA的5’-甲基鸟苷帽以及3’-腺苷尾的研究。而Oxford Nanopore测序仪的问世完美解决了上述的问题。Nanopore的关键技术有三：1）纳米孔：来源于天然的跨膜转运蛋白，并经过人工改造，是核酸链的测序通道；2）高电阻聚合物膜：锚定纳米孔蛋白，并保证测序时电流只能从纳米孔通过；3）动力蛋白：结合核酸并将其拖送至纳米孔，用于DNA测序的动力蛋白还兼具DNA解旋酶的功能（图5）。当动力蛋白-核酸复合体结合到纳米孔上时，测序开始：核酸链逐个碱基地通过纳米孔，由于四种碱基的电荷差异，会引起膜孔处不同的电流变化。电流信号经放大后被系统收集，通过软件算法实时翻译为核苷酸序列。由于碱基修饰后（如甲基化、乙酰化等）通过纳米孔的速度以及产生的电流大小都会发生变化，因此Nanopore可被用于碱基修饰测序。此外，Nanopore可以直接读取mRNA 3’-腺苷尾的长度，这为信使RNA剪接成熟机制以及稳定性的研究提供了有力工具。

Nanopore技术不仅大大简化了样品的准备流程，其最大的突破在于便携性的提升和检测成本的大幅优化。一些系列的设备仅有USB驱动器大小，2016年7月，一台MiniON测序仪搭乘SpaceX 9号进入到国际空间站，首次在太空微重力下完成了测序。此外，Nanopore大幅降低测序成本至仅万元水平。核酸测序技术，作为曾经大型机构的“堂前燕”，逐渐飞入了普通科研院所的“百姓家”。

图5 | Oxford Nanopore测序技术

总结

至此，三代测序技术已介绍完毕。三代技术的优缺点总结如图（图6）。我们传统的实验方法多是荧光半定量、ELISA和WesternBlotting等，所能提供的信息有限且可能存在一定的偏向性。相比而言，RNA测序技术可以为我们的工作提供多维度的信息作为补充，也能够给予研究更多的可靠性。随着测序成本的不断降低，RNA测序也将更加地普及，这对药学工作者来说也将是一个“福音”。

图6 | 几代测序技术的优缺点总结

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